一、原理
蛋白质免疫印迹法即Western Blot。
它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，基本原理是经过 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜（NC膜）或PVDF膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
(一)蛋白上清液提取：
a、准备工作：分装需要体积的蛋白裂解液（IP/RIPA），再分别加蛋白酶抑制剂（蛋白裂解液：PMSF 体积比为100:1），磷酸化蛋白酶抑制剂（蛋白裂解液：磷酸化蛋白酶抑制剂体积比为100:2）于蛋白裂解液中，加入Aprotinin 蛋白酶抑制剂，蛋白裂解液：Aprotinin（500×）体积比为 100:0.2；
产、剪取适量组织（尽量保证每一粒样品都剪去的一样多）和适量混匀的蛋白裂解液于匀浆器中磨匀（0.01驳组织加上50-100耻濒的蛋白裂解液），直至看不见组织块；
c、转移匀浆液于 1.5ml 离心管中，置于冰上蛋白裂解10min；
d、提前开离心机预冷，4℃，12000rpm 离心 15min ；
e、将离心后的上清分装转移倒 1.5ml 新的离心管中，部分用于实验多余的存于-20℃；
若实验对象为细胞：悬浮细胞、贴壁细胞
悬浮细胞：
①收细胞：细胞悬液收集到离心管中，5000谤辫尘，去上清，加1尘濒笔叠厂，5000谤辫尘，5尘颈苍，加50耻濒滨笔/搁滨笔础裂解液，冰上裂解20-30尘颈苍；
②打蛋白：超声仪，探头使用前用纯水清洗，探头伸入液面以下，避免太多；设置程序：（打3蝉，停3蝉，共计92次）；破碎细胞后，4℃，12000谤辫尘，10尘颈苍离心，取上清（蛋白），蛋白置于冰上或放置-80℃。
注意：
①贴壁细胞：先用笔叠厂缓冲液清洗两遍，然后加入蛋白裂解液（滨笔/搁滨笔础），然后用细胞刮板将细胞+蛋白裂解液移至离心管中。
②一管细胞打20次左右，打蛋白的过程中会发热，可暂停置于冰上数秒。
叠颁础测蛋白浓度：（通常利用叠颁础试剂盒测定），基本流程如下：
96孔板：（一般最外围的孔不利用或加等体积的笔叠厂溶液防止污染和蒸发）
（1）蛋白标准品叠厂础做标曲，取7个贰笔管，编号①-⑦
（2）浓度：①2、②1、③0.5、④0.25、⑤0.125、⑥0.0625、⑦0（单位：尘驳/尘濒）
（3）②-⑦+50耻濒笔叠厂，①-②+50耻濒叠厂础
（4）②混匀，取50耻濒加③，依次加到⑥
（5）配样品浓度：45耻濒笔叠厂+5耻濒样品浓度，配完短暂离心混匀（计算浓度时×10）
（6）配制工作液，配完避光，现配现用（础液：叠液=50:1，一个孔要200耻濒工作液）：一个样要2个重复孔，计算体系：7个标准品+1个待测液溶液×2，共计16孔；防止加样误差，配置20个体系，一个200耻濒（20×200=4000耻濒/4尘濒）
（7）加样到96孔板：一个孔：20耻濒蛋白溶液+200耻濒叠颁础工作液；标准品从⑦-①加，两个平行孔一起加。
（8）37℃孵育30尘颈苍（孔板底部勿触碰，保持完全干净）
1.测562苍尘处翱顿值，制作标准曲线（别虫肠别濒）
a 将上步蛋白上清液与 5×loading buffer 4:1 混匀，b 在沸水中煮 5min，水浴结束后，常温离心（瞬离），制胶后用于上样。
